Действие игры разворачивается в 2004 году. Главный герой — Леон Скотт Кеннеди, бывший также главным героем «Resident Evil 2». В начале игры Леон напоминает о недавнем решении Президента США уничтожить город Раккун-Сити (Raccoon City) ядерной ракетой и рассказывает о последующем падении акций, банкротстве и исчезновении корпорации «Umbrella». С тех событий прошло 6 лет, Леон работает в Секретной Службе США, и получает задание спасти дочь президента — Эшли Грэхем — которая была похищена неизвестными лицами.
Леон прибывает в деревню, где предположительно скрылись похитители. В скором времени его атакуют местные жители, которые, судя по их поведению, несколько не в себе. По мере развития сюжета игрок узнает о паразитическом организме Лас Плагас (Las Plagas), ископаемые образцы которого были в шахтах, где работали жители деревни. Как оказалось, Лас Плагас выделяли споры, которые попадали в тела жителей и развивались там. Лас Плагас, как упоминается в игре, полностью управляют телом носителя и, вероятно, обладают коллективным разумом. Дальше распространение Лас Плагас подталкивалось местным аристократом Рамоном Салазаром, а также неким Озмундом Саддлером, организатором религиозной секты Лос Иллюминадос, пропагандистом идеи нового мира, который способен управлять паразитами в телах зараженных.
Позже в игре появляются персонажи из старых частей — Ада Вонг и Альберт Вескер, которые хотят захватить образец Лас Плагас с целью использования его для усовершенствования Т-вируса и восстановления «Umbrella». Но в конце выясняется, что Ада водит Вескера за нос, и передаёт паразита некоей организации, которая поручила ей следить за Вескером и играть с ним в кошки-мышки, о чём говорит фраза, адресованная Вескеру вне связи: «Наверное, ты забыл, Вескер, — я не всегда играю по твоим правилам…». НО как выясняется в «Resident Evil 5» Вескер всё же смог завладеть образцом Лас Плагас.